Técnicas analíticas y de control microbiológico análisis comunes a todas las monografías
RESOLUCIÓN OIV-OENO 632-2021
TÉCNICAS ANALÍTICAS Y DE CONTROL MICROBIOLÓGICO ANÁLISIS COMUNES A TODAS LAS MONOGRAFÍAS
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ATENCIÓN: Esta resolución modifica las siguientes resoluciones: - OENO 17/2003 - OIV-OENO 328-2009 - OIV-OENO 329-2009 |
LA ASAMBLEA GENERAL,
VISTO el artículo 2, párrafo 2 b) iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001, por el que se crea la Organización Internacional de la Viña y el Vino,
A PROPUESTA del Grupo de expertos “Microbiología”,
CONSIDERANDO la necesidad de actualizar las técnicas analíticas y de control microbiológico,
DECIDE reorganizar y modificar los apartados 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de la ficha F-COEI-2-CONBAC del Codex Enológico Internacional como sigue (en este proyecto de resolución solo se recogen las siete primeras páginas de la ficha F-COEI-2-CONBAC, dado que las modificaciones no afectan al resto de páginas):
1. Rehidratación previa de las levaduras (Saccharomyces y no Saccharomyces): LSA (levaduras secas activas), AFY (levaduras congeladas activas), COY (levaduras comprimidas), CRY (crema de levaduras), ENY (levaduras encapsuladas y levaduras inmovilizadas), levaduras del licor de tiraje
En condiciones de esterilidad, pesar unos 10 g del preparado (anotar el peso exacto para calcular la concentración).
En condiciones de esterilidad, llevar a 100 mL con agua peptonada estéril* a 20-37 °C o según las indicaciones del fabricante.
Homogeneizar con cuidado durante 5 min con una varilla, una técnica de stomacher o un agitador magnético.
Detener la agitación y dejar reposar durante 20 min a temperatura ambiente (20-30 °C).
Homogeneizar de nuevo a temperatura ambiente durante 5 min.
En condiciones de esterilidad, preparar diluciones decimales seriadas con agua o agua peptonada estéril* y realizar los controles microbiológicos con la solución madre homogeneizada.
En el caso de las levaduras de tiraje de los vinos espumosos, tomar 1 mL en condiciones de esterilidad, preparar diluciones decimales seriadas con agua o agua peptonada estéril* y realizar los controles microbiológicos con la solución madre homogeneizada.
* Solución salina de peptona: peptona bacteriológica 1 g/L, cloruro de sodio 8,5 g/L, pH final 7,0.
2. Rehidratación previa de los preparados de bacterias lácticas
En condiciones de esterilidad, pesar unos 10 g del preparado de bacterias lácticas (anotar el peso exacto para calcular la concentración).
En condiciones de esterilidad (25 °C), enrasar a 100 mL con agua peptonada estéril*.
Homogeneizar con un agitador magnético o una técnica de stomacher durante 5 min.
Detener la agitación y dejar reposar durante 20 min a temperatura ambiente (20-30 °C).
Homogeneizar durante 5 min a temperatura ambiente.
En condiciones de esterilidad, preparar diluciones decimales seriadas con agua o agua peptonada estéril* y realizar los controles microbiológicos.
* Solución salina de peptona: peptona bacteriológica 1 g/L, cloruro de sodio 8,5 g/L, pH final 7,0.
3. Control microbiológico de otros productos del Codex Enológico Internacional
(productos para los que se solicita el control de levaduras, bacterias y/o mohos)
Pesar unos 10 g del producto enológico en condiciones de esterilidad (anotar el peso exacto para calcular la concentración).
En condiciones de esterilidad, enrasar a 100 mL con agua peptonada estéril*.
Homogeneizar con un agitador magnético o una técnica de stomacher durante 5 min.
En condiciones de esterilidad, preparar diluciones decimales seriadas con agua o agua peptonada estéril* y realizar los controles microbiológicos.
* Solución salina de peptona: peptona bacteriológica 1 g/L, cloruro de sodio 8,5 g/L, pH final 7,0.
4. Recuento de levaduras totales
Medio YM agar (MALT WICKERHAM)
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Agar bacteriológico |
15 g |
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Extracto de levadura |
3 g |
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Extracto de malta |
3 g |
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Peptona |
5 g |
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Glucosa |
10 g |
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Agua |
c.s.p. 1000 mL |
YPD
|
Extracto de levadura |
10 g |
|
Peptona |
20 g |
|
Glucosa |
20 g |
|
Agar |
10 g |
|
Agua |
c.s.p 1000 mL |
Inmediatamente después de su preparación, esterilizar el medio en autoclave a 120 °C durante 20 min.
Si el período de incubación es largo, añadir cloranfenicol a una concentración final de 100 mg/L para evitar la proliferación de bacterias.
Después de la inoculación con las diluciones de la muestra que correspondan para obtener 30-300 colonias, las placas se incuban a 25-30 °C en aerobiosis durante 48-72 horas.
Contar el número de UFC de las placas con entre 30 y 300 colonias y expresar en función de la masa de extracto seco.
Además de los medios propuestos, se puede utilizar cualquier otro medio equivalente reconocido internacionalmente para el cultivo de estos microorganismos.
5. Recuento de levaduras no Saccharomyces
5.1. Medio de lisina
Las levaduras se cultivan en un medio de lisina cuya composición es la siguiente:
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Agar |
20 g |
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Monohidrocloruro de L-lisina |
5 g |
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Glucosa |
1 g |
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Púrpura de bromoscresol |
0.015 g |
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Agua |
q.s. 1000 mL |
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Ajusta |
pH 6.8 |
Llevar a ebullición y mantener durante 1 min para garantizar la disolución completa. A continuación, esterilizar en autoclave a 120 °C durante 20 min.
Si el período de incubación es largo, añadir cloranfenicol a una concentración final de 100 mg/L para evitar la proliferación de bacterias.
Después de la inoculación con las diluciones de la muestra, las placas se incuban a 25 °C o 30 °C durante 48-96 horas.
Contar el número de UFC (placas con entre 30 y 300 colonias) y expresar en función de la masa de extracto seco.
Además de los medios propuestos, se puede utilizar cualquier otro medio equivalente reconocido internacionalmente para el cultivo de estos microorganismos.
5.2. Medio YPD enriquecido con cicloheximida (10 mg/L) e incubación durante 6-7 días en aerobiosis
Si el período de incubación es largo, añadir cloranfenicol a una concentración final de 100 mg/L para evitar la proliferación de bacterias.
6. Recuento de bacterias lácticas viables
MRS (Man, Rogosa y Sharpe) modificado
Las bacterias se cultivan en un medio MRS líquido (Man, Rogosa, Sharpe 1960) enriquecido con zumo de tomate cuya composición es la siguiente:
|
Agar agar |
15 g |
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Bacto-peptona |
10 g |
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Extracto de carne |
8 g |
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Extracto de levadura |
4 g |
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Acetato de sodio |
5 g |
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2 g |
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Citrato de trisodio |
2 g |
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Mg |
2.5 mL |
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Mn |
2 mL |
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Tween 80 |
1 mL |
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Acido DL málico |
5g |
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Zumo de tomate* |
200 mL |
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Glucosa 20 g, o glucosa 10 g+fructosa 10 g |
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HCl o NaOH |
c.s.p. pH 4,8 |
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Agua destilada |
c.s.p 1000 mL |
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c.s.p. (cantitadad suficiente para) |
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a 100mg/L* El zumo de tomate se utiliza para mejorar el crecimiento de las bacterias lácticas. Preparación: zumo de tomate industrial (sin aditivos) o casero; centrifugar 20 min a 4000g; filtrar en caso necesario y utilizar el líquido transparente.
Esterilizar en autoclave durante 20 min a 110 °C.
En el momento de verter el medio en la placa de Petri, añadir pimaricina a una concentración final de 10 mg/L para inhibir la proliferación de levaduras y mohos.
Incubar a 25 °C durante 8-10 días en anaerobiosis.
Además de los medios propuestos, se puede utilizar cualquier otro medio equivalente reconocido internacionalmente para el cultivo de estos microorganismos.
7. Recuento de mohos
Medio Czapek-Dox agar
|
Agar |
15 g |
|
Sacarosa |
30 g |
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Na |
3 g |
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1 g |
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Mg |
0.5 g |
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KCl |
0.5 g |
 |
0.01 g |
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Agua |
c.s.p. 1000 mL |
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Ajustar |
pH 7 |
Esterilizar en autoclave durante 20 min a 120 °C.
Para inhibir la proliferación de bacterias, añadir cloranfenicol a una concentración final de 100 mg/L directamente en la placa de Petri que contiene el medio.
Incubar en aerobiosis a 20 °C durante 10 días.
Además de los medios propuestos, se puede utilizar cualquier otro medio equivalente reconocido internacionalmente para el cultivo de estos microorganismos.
8. Recuento de bacterias acéticas
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Agar bacteriológico |
20 g |
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Extracto de levadura |
5 g |
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Hidrolizado de caseína |
5 g |
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Glucosa |
10 g |
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Adjustar a |
pH 4.5 |
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Agua |
c.s.p 1000 mL |
Esterilizar en autoclave durante 20 min a 120 °C.
En el momento de verter el medio en la placa de Petri, añadir pimaricina a una concentración final de 100 mg/L para inhibir la proliferación de levaduras y mohos, y penicilina a una concentración final de 12,5 mg/L para inhibir la proliferación de bacterias lácticas.
Incubar en aerobiosis a 25 °C durante 4 días.
Además de los medios propuestos, se puede utilizar cualquier otro medio equivalente reconocido internacionalmente para el cultivo de estos microorganismos.