RESOLUTION OIV-OENO 662A-2022

BESTIMMUNG VON OCHRATOXIN A IN TRAUBENSAFT, RÜCKVERDÜNNTEM TRAUBENSAFT, KONZENTRIERTEM TRAUBENSAFT UND TRAUBENNEKTAR MITTELS IMMUNAFFINITÄTSSÄULE UND Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie MIT FLUORESZENZDETEKTION

DIE GENERALVERSAMMLUNG,

GESTÜTZT auf Artikel 2 Absatz 2 iv des Übereinkommens vom 3. April 2001 zur Gründung der Internationalen Organisation für Rebe und Wein,

AUF VORSCHLAG der Unterkommission „Analysemethoden“,

BESCHLIESST, die folgende Methode einzufügen: 

Bestimmung von Ochratoxin A in Traubensaft, rückverdünntem Traubensaft, konzentriertem Traubensaft und Traubennektar mittels Immunaffinitätssäule und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit Fluoreszenzdetektion

Typ IV-Methode

Für Traubensaft, rückverdünnten Traubensaft und Traubennektar: Anwendung der Methode OIV-MA-AS315-10 der Sammlung internationaler Analysemethoden für Wein und Most

Für konzentrierten Traubensaft: Der Saft wird im Verhältnis 1:5 (m/m) mit Wasser verdünnt, bevor wie in Ziffer 5.1 beschrieben vorgegangen wird. Diese Verdünnung wird bei der endgültigen Berechnung der OTA-Konzentration in folgender Gleichung als Verdünnungsfaktor (F) berücksichtigt:

Methodenvorschlag:

Bestimmung von Ochratoxin A in Traubensaft, rückverdünntem Traubensaft, konzentriertem Traubensaft und Traubennektar mittels Immunaffinitätssäule und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit Fluoreszenzdetektion

Typ IV-Methode

1.      Anwendungsgebiet

Die Methode dient der Bestimmung von Ochratoxin A (OTA) in Traubensaft, rückverdünntem Traubensaft, konzentriertem Traubensaft und Traubennektar in Konzentrationen von 0,2 μg/L bis 10 μg/L.

2.      Prinzip

Die Methode nutzt eine Immunaffinitätssäule und die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). OTA wird mit Methanol eluiert und durch HPLC nach Trennung mittels Umkehrphase und Fluoreszenzdetektion quantitativ bestimmt.

3.      Reagenzien und Chemikalien

3.1.      Reagenzien zur Trennung von OTA an einer Immunaffinitätssäule. Die unten aufgeführten Reagenzien dienen als Anhaltspunkt. Werden von Lieferanten von Immunaffinitätssäulen Verdünnungslösungen und Eluenten angeboten, die für ihre Produkte geeignet sind, sollten diese vorzugsweise verwendet werden.

3.1.1.     di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na₂HPO₄∙2H₂O) CAS [10028-24-7]

3.1.2.     Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH₂PO₄∙ H₂O) CAS [10049-21-5]

3.1.3.     Natriumchlorid (NaCl) CAS [7647-14-5]

3.1.4.     Reinstwasser für Laborzwecke, z.B. gemäß EN ISO 3696 

3.1.5.     Phosphatpuffer (Verdünnungslösung)

60.0 g Na₂HPO₄∙2H₂O (3.1.1) und 8,8 g NaH₂PO₄∙H₂O (3.1.2) in 950 mL Wasser lösen (3.1.4)  und mit Wasserauf 1 Liter auffüllen

3.1.6.     Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Waschlösung)

2,85 g Na₂HPO₄∙2H₂O (3.1.1), 0,55 g NaH₂PO₄∙H₂O (3.1.2) und 8,70 g NaCl in 950 mL Wasser lösen und mit Wasser (3.1.4) auf 1 Liter auffüllen

3.1.7.     Methanol (Reinheit ≥ 99,9 %) (CH₃OH) CAS [67-56-1]

3.2.      Reagenzien für die HPLC

3.2.1.     Acetonitril für HPLC (CH3CN) CAS [75-05-8]

3.2.2.     Essigsäure (Reinheit 100 %) (CH3COOH) CAS [64-19-7]

3.2.3.     Mobile Phase: Wasser: Acetonitril: Essigsäure, 99:99:2, v/v/v (Richtwerte)

990 mL Wasser (3.1.4) mit 990 mL Acetonitril (3.2.1) und 20 mL Essigsäure (3.2.2) mischen. Ungelöste Bestandteile durch ein Filter (0,45 μm) filtrieren. Entgasen (z.B. mit Helium), sofern die verwendete HPLC-Anlage keinen Entgasungsschritt umfasst. 

3.3.      Reagenzien für die Herstellung der OTA-Stammlösung

3.3.1.     Toluol (C₆H₅CH₃) CAS [108-88-3]

3.3.2.     OTA (Reinheit ≥ 99,5 %) CAS [303-47-9]

3.3.3.     Lösemittelgemisch (Toluol: Essigsäure, 99:1, v/v).

99 Volumenteile Toluol (3.3.1) mit einem Volumenteil Essigsäure mischen (3.2.2)

Eine handelsübliche Lösung einer Standardkonzentration (ca. 50 μg/mL) mit einem Analysezertifikat, in dem der Referenzwert und die Unsicherheit der Konzentration angegeben sind, ist der Verwendung von OTA in fester Form vorzuziehen.

3.4.      OTA-Stammlösung

1 mg OTA in einem Kolben lösen oder, wenn das OTA nach dem Verdampfen in Form eines Films vorliegt, den gleichen Gehalt im Lösungsmittelgemisch (3.3.3) lösen, um eine Lösung mit einer Konzentration von etwa 20 bis 30 μg/mL OTA zu erhalten.

Zur Bestimmung der genauen Konzentration wird ggf. das Absorptionsspektrum zwischen 300 und 370 nm in einer Quarz-Küvette mit einer optischen Weglänge von 1 cm aufgenommen, wobei das Lösungsmittelgemisch (3.3.3) als Blindprobe verwendet wird. Die Bestimmung des Absorptionsmaximums und die Berechnung der OTA-Konzentration (COTA) in μg/mL erfolgt nach der folgenden Gleichung:

εδ

Hierbei sind:

= Absorption, bestimmt durch die maximale Wellenlänge (etwa 333 nm)

M = OTA Molmasse = 403,8 g/mol

ε = molarer Extinktionskoeffizient von OTA im Lösungsmittelgemisch (3.3.3) (ε = 544 m²/mol)

δ = optische Weglänge (cm)

Die Lösung ist bei -18° C mindestens 4 Tage haltbar.

3.5.      OTA-Standardlösung, 2 μg/mL (Toluol: Essigsäure, 99:1, v/v)

Die Stammlösung (3.4) mit dem Lösungsmittelgemisch (3.3.3) verdünnen, um eine OTA-Standardlösung mit einer Konzentration von 2 μg/mL zu erhalten.

Die Lösung kann bei + 4 °C im Kühlschrank aufbewahrt werden. Ihre Stabilität sollte bei Gebrauch überprüft werden.

4.      Geräte

Übliches Labormaterial, insbesondere:

4.1.      Glasröhrchen (4 mL)

4.2.      Analysenwaage

4.3.      Messkolben

4.4.      Vollpipetten

4.5.      Mikropipetten

4.6.      Festphasenextraktion (SPE-System) für Immunaffinitätssäulen

4.7.      Reservoir und Strömungsrohr für Immunaffinitätssäulen

4.8.      Mikrofaserfilter aus Glas

4.9.      Immunaffinitätssäule für OTA

Die Säule sollte eine Beladungskapazität von mindestens 100 ng OTA aufweisen. Dadurch wird eine Aufreinigung von mindestens 80 % ermöglicht, wenn eine verdünnte Lösung der Probe aufgegeben wird, die 100 ng OTA enthält. 

4.10. Flüssigkeitschromatograph mit Pumpe für die mobile Phase, die eine konstante Flussrate von 1 mL/mn für die isokratische erreichen kann. Das Einspritzsystem muss mit einer Schleife von 100 μL ausgestattet sein.

4.11. HPLC-Säule aus Stahl 150 × 4,6 mm (Innendurchmesser) befüllt mit stationärer Phase (C18, 5 μm). Es wird eine Vorsäule oder ein Vorfilter (0,5 μm) mit einer geeigneten Phase vorgeschaltet. Es können Säulen unterschiedlicher Größe verwendet werden, sofern sie ein gutes Basislinienrauschen und Hintergrundgeräusch gewährleisten, die unter anderem die Identifizierung von OTA-Peaks ermöglichen.

4.12.  Der Fluoreszenzdetektor wird an die Säule angeschlossen, die Anregungswellenlänge auf 333 nm und die Emissionswellenlänge auf 460 nm eingestellt.

4.13.  Datenverarbeitungssystem

4.14.  UV-Spektrophotometer.

5.      Probenvorbereitung (als Anhaltspunkt)

5.1.      Für Traubensaft, rückverdünnten Traubensaft und Traubennektar

10 mL Probe in einen 100-mL-Erlenmeyerkolben geben, 10 mL Verdünnungslösung (3.1.5) zugeben und gut mischen. Durch ein Mikrofaserfilter aus Glas (4.8) filtrieren. Bei trüben Lösungen oder bei Ausfällungen nach dem Lösen ist eine Filtration erforderlich. 

5.2.      Für konzentrierten Traubensaft

Zunächst wird der Saft im Verhältnis 1:5 (m/m) mit Wasser (3.1.4) verdünnt. Diese Verdünnung wird bei der endgültigen Berechnung der OTA-Konzentration berücksichtigt (8). Dann 10 mL der verdünnten Probe in einen 100-mL-Erlenmeyerkolben geben, 10 mL Verdünnungslösung (3.1.5) zugeben und gut mischen. Durch ein Mikrofaserfilter aus Glas (4.8) filtrieren. Bei trüben Lösungen oder bei Ausfällungen nach dem Lösen ist eine Filtration erforderlich. 

6.      Durchführung

6.1.      Aufreinigung mittels Immunaffinitätssäule (als Beispiel):

Die Proben werden gemäß den Anweisungen des Kit-Herstellers mit einem geeigneten Lösungsmittel verdünnt. Diese Lösung wird filtriert und über eine Immunaffinitätssäule gereinigt Die Immunaffinitätssäule (4.9) an das SPE-System anschließen (4.6) und das Reservoir (4.7) anbringen.

10 mL (entspricht 5 mL Probe) der verdünnten Lösung in das Reservoir geben. Die Lösung wird mit einem Durchfluss von 1 Tropfen pro Sekunde durch die Immunaffinitätssäule geleitet. Die Immunaffinitätssäule sollte nicht trocken laufen. Die Immunaffinitätssäule mit 5 mL Waschlösung (3.1.6) und dann mit 5 mL Wasser (3.1.4) mit einem Durchfluss von 1 bis 2 Tropfen pro Sekunde waschen. Luft durch die Säule blasen. OTA in einem Glasröhrchen (4.1) mit 2 mL Methanol (3.1.7) mit einem Durchfluss von 1 Tropfen pro Sekunde eluieren. Das Eluat bei 50° C mit Stickstoff zur Trockene eindampfen, sofort wieder in 250 μl mobiler Phase (3.2.3) lösen und bis zur HPLC-Analyse bei 4° C aufbewahren.

6.2.      HPLC-Analyse

Über die Injektionsschleife 100 μl des wiederaufgelösten Extraktionsrückstands  in das HPLC-System spritzen.

Betriebsbedingungen (als Beispiel)

Flussrate: 1 mL /min

Mobile Phase:  Acetonitril: Wasser: Essigsäure (99:99:2, v/v/v) (3.2.3)

Fluoreszenzdetektor: Anregungswellenlänge = 333 nm

Emissionswellenlänge = 460 nm

Einspritzvolumen: 100 μL

7.      Bestimmung von Ochratoxin A (OTA)

Für die quantitative Bestimmung von OTA sollte die Peakfläche oder die Peakhöhe zu der Retentionszeit von OTA gemessen und mit der Kalibrierkurve verglichen werden. 

7.1.      Kalibrierkurve (als Beispiel)

Die Kalibrierkurve ist täglich oder bei Veränderung der chromatographischen Bedingungen zu erstellen. 0,5 mL OTA-Standardlösung (3.5) mit einer Konzentration von 2 μg/mL in ein Glasröhrchen (4.1) einwiegen und unter Verwendung von Stickstoff abdampfen. Erneut 10 mL in der mobilen Phase (3.2.3) lösen, die zuvor durch ein Filter (0,45 μm) filtriert wurde. Man erhält so eine OTA-Lösung von 100 µg/L. Es werden mindestens 6 HPLC-Kalibrierlösungen in fünf 5 mL-Messkolben gemäß Tabelle 1 (Beispiel) hergestellt.

Die 5 mL Standardlösung jeweils mit der mobilen Phase auffüllen (3. 2.3).

100 μL jeder Lösung in das HPLC-System spritzen.

Tabelle 1: Kalibrierkurve

Kalibrierstandards	Std 1	Std 2	Std 3	Std 4	Std 5	Std 6
µL filtrierte mobile Phase HPLC (3.2.3)	4990	4975	4950	4900	4770	4500
µL OTA-Lösung, 100 µg/L	10	25	50	100	250	500
OTA-Konzentration (µg/L)	0,2	0,5	1,0	2,0	5,0	10
eingespritzte OTA (ng)	0,02	0,05	0,10	0,20	0,50	1,00

HINWEISE:

1. Liegt die OTA-Konzentration der Proben außerhalb des Kalibrierbereichs, sollte eine entsprechende Verdünnung vorgenommen werden. Die Berechnung der Endkonzentration (8) sollte dann von Fall zu Fall überprüft werden. 
2. Die kritischen Punkte der Methode zur Messung von Ochratoxin A mittels Immunaffinitätssäule sind in Anhang III der Methode OIV-MA-AS315-10 angeführt.

8.      Berechnungen

Die OTA-Konzentration wird in einem aliquoten Teil der getesteten und in die HPLC-Säule eingespritzten Lösung berechnet.

Die Berechnung der OTA-Konzentration (COTA) in µg/L erfolgt nach der folgenden Formel:

Hierbei sind:

MA die Masse des Ochratoxin A (in ng), die in einem aliquoten Teil der Probe in die Säule eingespritzt und mit der Kalibrierkurve ausgewertet wird 

F der Verdünnungsfaktor

das zu analysierende Probevolumen (0,01 L)

das Volumen der getesteten und in die Säule eingespritzten Lösung (100 μL)

das Volumen der Lösung, mit der das trockene Eluat gelöst wird (250 μL)

Die Wiederfindungsrate der Immunaffinitätssäulen muss im Falle einer direkten Kalibrierung mit synthetischen Lösungen berücksichtigt werden.

9.      Angabe der Ergebnisse

Die OTA-Konzentration wird unter Berücksichtigung der Messunsicherheit in Mikrogramm pro Liter (µg/L) mit zwei Dezimalstellen angegeben.

10.    Eigenschaften der Methode

Es wurde eine interne Validierungsstudie durchgeführt, um die Eignung der Methode für Traubensaft unter Berücksichtigung der Linearität, der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen und der Genauigkeit der Methode zu beurteilen. Der letztgenannte Parameter wurde anhand der Präzision und der Richtigkeit der Methode ermittelt.

10.1. Linearität der Methode

Aus den Ergebnissen der linearen Regressionsanalyse geht hervor, dass die Methode in den in Abbildung 1 und Tabelle 2 aufgeführten Bereichen linear ist.

Abbildung 1:  OTA Kalibrierkurve

 

Abbildung 2: Chromatogramm eines OTA-Standards (2,0 μg/L)

10.2. Nachweis- und Bestimmungsgrenze

Die Nachweisgrenze (LD) und die Bestimmungsgrenze (LQ) wurden anhand einer Serie von 8 Wiederholbestimmungen eines Traubensafts dotiert mit 0,10 μg/L OTA berechnet und entsprechen 3 Standardabweichungen für die LD und 10 Standardabweichungen für die LQ (Tabelle 2).

10.3. Genauigkeit der Methode

Berücksichtigt wurden die Wiederholbarkeit und die Reproduzierbarkeit. Die Werte dieser Parameter sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Wiederholbarkeit wurde ausgedrückt als die relative Standardabweichung bei Messungen, die für verschiedene im Traubensaft vorgefundene Konzentrationen wiederholt wurden. Die Reproduzierbarkeit wurde ausgedrückt als Mittelwert der relativen Standardabweichung bei Messungen derselben Traubensaftprobe, die von verschiedenen Betreibern durchgeführt wurden.

10.4. Richtigkeit der Methode

Die Wiederfindungsrate wurde anhand einer Traubensaftprobe bestimmt, die mit OTA in 6 Konzentrationen (0,10 μg/L - 10 μg/L) dotiert wurde. Für jede Konzentration wurden 5 Bestimmungen durchgeführt. Ein Chromatogramm ist als Beispiel in Abbildung 3 aufgeführt.

Abbildung 3: Beispiel eines Chromatogramms eines Traubensafts (a) und eines mit 2 μg/L OTA dotierten Traubensafts (b).

Tabelle 2: Eigenschaften der Methode

Linearitäts-bereich (μg/L)	Bestimmungs-koeffizient (r2)	LD (μg/L)	LQ (μg/Ll)	Wiederholbar-keit (n=7) RSD%	Reproduzier-barkeit  (n=7) RSD%	Wieder-findung (%)
0,20 - 10	0,9999	0,12	0,22	4,79	5,17	104,2 ± 2,9

11.    Literatur

1. OIV-Sammlung internationaler Analysemethoden für Wein und Most, Methode OIV-MA-AS315-10.
2. ISO 3696 Wasser für Analysezwecke — Spezifikationen und Testverfahren (ISO 3696:1995)