РЕЗОЛЮЦИИ OIV-OENO 728-2025

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОШЕНИЙ ИЗОТОПОВ 13C/12C и 15N/14N ХИТОЗАНА МЕТОДОМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ИЗОТОПНЫХ ОТНОШЕНИЙ

ГЕНЕРАЛЬНАЯ АССАМБЛЕЯ,

НА ОСНОВАНИИ статьи 2, пункта 2 iv Соглашения от 3 апреля 2001 года о создании Международной организации по виноградарству и виноделию,

ПРИНИМАЯ ВО ВНИМАНИЕ работу Экспертной группы «Спецификации винодельческой продукции»,
ПРИНИМАЕТ РЕШЕНИЕ по предложению Комиссии II «Энология» о внесении поправок в Спецификацию COEI-1-CHITOS Главы I Международного энологического кодекса путем добавления следующего предложения, выделенного курсивом, в раздел 5.1.2 Определение происхождения: «Метод, описанный в Приложении VIII, и приведенные граничные значения для отношений различных изотопов могут быть использованы для определения происхождения хитозана (из ракообразных или из грибов).»

ПРИНИМАЕТ РЕШЕНИЕ по предложению Комиссии II «Энология» о добавлении указанного ниже метода в виде Приложения VIII к Спецификации COEI-1-CHITOS Главы I Международного энологического кодекса:

ПРИЛОЖЕНИЕ VIII

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОШЕНИЙ ИЗОТОПОВ ¹³C/¹²C и ¹⁵N/¹⁴N ХИТОЗАНА МЕТОДОМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ИЗОТОПНЫХ ОТНОШЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Хитозан – линейный полисахарид, состоящий из β(1-4)-связанного D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина и имеющий ряд коммерческих применений. В энологии он используется в качестве антиоксиданта, средства осветления вина, хелатирующего вещества, связывающего металлы, а также для контроля развития микроорганизмов, что позволяет ограничить использование сульфитов.

Хитозан получают путем деацетилирования хитина. Последний выделяют из внешних покровов ракообразных или из мицелия грибов. В энологии допускается использование только хитозана, полученного из хитина грибов.

Литературные данные показывают, что отношения изотопов ¹³C/¹²C и ¹⁵N/¹⁴N хитозана позволяют отличить продукты, полученные из внешних покровов ракообразных, от продуктов, полученных из мицелия грибов.

Описанный здесь метод и приведенные граничные значения для отношений различных изотопов могут быть использованы для определения происхождения хитозана (из ракообразных или из грибов).

ВНИМАНИЕ. Некоторые реагенты, используемые в данном методе, представляют опасность: при их использовании следует соблюдать особую осторожность. Оператору рекомендуется соблюдать инструкции, приведенные на этикетке на упаковке с реагентом, обращаться к паспортам безопасности для получения специальной информации об опасности используемых реагентов и способах их утилизации.

1.      ЦЕЛЬ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Цель метода – анализ отношений изотопов ¹³C/¹²C и ¹⁵N/¹⁴N хитозана масс-спектрометрическим методом определения отношения изотопов (IRMS).

2.      ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В настоящем документе используются следующие определения:

¹³C/¹²C: Отношение изотопов углерода-13 к изотопам углерода-12 для данного образца.

δ¹³C: Отношение между изотопами углерода-13 (¹³C) и углерода-12 (¹²C), выраженное в виде дельты в промилле (‰).

¹⁵N/¹⁴N: Отношение изотопов азота-15 к изотопам азота-14 для данного образца.

δ¹⁵N: Отношение между изотопами азота-15 и азота-14, выраженное в виде дельты в промилле (‰).

V-PDB (Венский стандарт изотопного состава углерода): Международный эталонный стандарт для расчета δ¹³C.

V-AIR (Атмосферный воздух): Международный эталонный стандарт для расчета δ¹⁵N.

3.      ПРИНЦИП

Выполняют анализ хитозана. Отношения стабильных изотопов C и N анализируют с помощью масс-спектрометра изотопных отношений (IRMS), соединенного с элементным анализатором (EA), путем измерения ионных токов:

• m/z = 44 (12C16O16O) и m/z = 45 (13C16O16O), возбуждаемых диоксидом углерода, полученным при сжигании исходного образца в элементном анализаторе,
• m/z = 28 (14N2) и m/z = 29 (15N14N), возбуждаемых азотом, полученным при сжигании исходного образца в элементном анализаторе.

4.      РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ

Реагенты и расходные материалы зависят от используемого лабораторией оборудования. Для сжигания образцов в большинстве случаев используют элементные анализаторы. Оборудование может быть оснащено автоматическими системами для введения образцов, помещенных в герметичные металлические капсулы.
В лаборатории могут использоваться любые эталонные материалы, сертифицированные по международным стандартам, в дополнение к указанным в таблице в 4.3.

4.1.      Расходные материалы

4.1.1. Абсолютный этиловый спирт (номер CAS 64-17-5);

4.1.2. Гелий для анализа (номер CAS 07440-59-7);

4.1.3. Кислород для анализа (номер CAS 07782-44-7);

4.1.4. Реагенты окислители и восстановители для систем сжигания и пиролиза, например, оксид меди (II) для элементного анализа (номер CAS 1317-38-0);

4.1.5. Водопоглощающий реагент для удаления воды, образующейся при сгорании. Например, ангидрон для элементного анализа (перхлорат магния) (номер CAS 10034-81-8). Не требуется при использовании оборудования, оснащенного системой удаления воды через криогенную или капиллярную ловушку с избирательной проницаемостью.

4.1.6. Одноразовые капсулы из олова.

4.2.      Рабочие стандартные образцы

4.2.1. Диоксид углерода (CO₂) (номер CAS 00124-38-9) чистотой не менее 99,998 % и азот (N₂) чистотой не менее 99,999 % в качестве стандартного газа для измерений.

4.2.2. Рабочие и контрольные стандартные образцы со значениями δ¹³C и δ¹⁵N, калиброванные по международным эталонным материалам.

4.3.      Наиболее часто используемые эталонные материалы с сертифицированными значениями δ13C и δ15N

Название	Материал	δ13C по сравнению с V-PDB ‰	δ15N по сравнению с AIR ‰
USGS40	Глутаминовая кислота	−26,39 ± 0,04	−4,52 ± 0,06
USGS42	Порошок человеческих волос, Tибет	−21,09 ± 0,10	+8,05 ± 0,10
USGS43	Порошок человеческих волос, Индия	−21,28 ± 0,10	+8,44 ± 0,10
USGS54	Порошок из древесины широкохвойной скрученной сосны, Канада	−24,43 ± 0,02	−2,42 ± 0,32
USGS55	Порошок из древесины двенадцатитычинковой кордии, Мексика	−27,13 ± 0,02	−0,3 ± 0,4
USGS56	Порошок из древесины умнини, ЮАР	−24,34 ± 0,01	+1,8 ± 0,4
USGS90	Просяная мука, Тоскана, Италия	−13,75 ± 0,06	+8,84 ± 0,17
IAEA-600	Кофеин	−27,771 ± 0,043	+1,0 ± 0,2

5.      ОБОРУДОВАНИЕ

Стандартное лабораторное оборудование и, в частности, следующее оборудование:

5.1.      Масс-спектрометр для определения отношений изотопов (IRMS)

Масс-спектрометр для определения отношений изотопов, позволяющий определять относительное содержание тяжелого изотопа по сравнению с легким изотопом в диоксиде углерода и азоте, получаемых при сжигании образца, с точностью измерений 0,1 ‰ для C, 0,2 ‰ для N. Точность измерений в данном случае определяется как разница между двумя значениями, полученными для одного и того же образца газа.

Используемый масс-спектрометр должен быть оснащен серией токоприемников для одновременного измерения ионных токов m/z = 44, 45, 46; или m/z = 28, 29, 30.

Путем измерения соответствующих интенсивностей, например, отношение изотопов ¹³C/¹²C определяется с помощью отношения интенсивностей m/z = 45 и m/z = 44 после внесения поправки на изобарные молекулы ¹²C¹⁷O¹⁶O, влияние которых можно рассчитать как функцию от интенсивности тока, измеренную для m/z = 46, и относительной распространенности ¹⁸O и ¹⁷O (поправка Крейга).

Масс-спектрометр для определения отношений изотопов должен быть оснащен:

• системой двустороннего напуска для поочередного измерения исследуемого образца и стандарта,
• или системой непрерывной подачи, которая обеспечивает подачу в масс-спектрометр того количества газов, которое образуется при сжигании проб и рабочих стандартных образцов.

5.2.      Элементный анализатор (EA)

Оборудование для сжигания, которое позволяет обеспечить количественное преобразование образца в диоксид углерода (при сжигании) и разделение газов с удалением воды без фракционирования изотопов. Оборудование может представлять собой систему непрерывной подачи, встроенную в масс-спектрометр, либо автономную систему сжигания. В последнем случае газы собирают в специальные емкости, которые затем соединяют с масс-спектрометром для определения отношений изотопов (IRMS).

5.3. Микроаналитические весы (мин. диапазон 0-100 мг, мин. точность 0,01 мг)

5.4. Центрифуга

5.5. Установка для лиофильной сушки или прибор для высушивания образцов

6.      ПРОЦЕДУРА

6.1.      Подготовка образца к анализу

10 г хитозана трижды промывают 10% об./об. водным раствором химически чистого этанола. Затем образец центрифугируют и подвергают лиофильной сушке.

6.2.      Анализ изотопных отношений

При проведении инструментальных измерений соблюдается порядок действий, описанный в инструкции по эксплуатации прибора, и рекомендованный техническими специалистами производителя оборудования.

Приведенное ниже описание относится к процедуре, которая, как правило, выполняется при сжигании или пиролизе проб с помощью коммерческих автоматизированных систем сжигания. Допускается использование других методов, обеспечивающих количественное преобразование образцов в диоксид углерода и азот без потерь, обусловленных испарением.

6.2.1 Помещение образцов в капсулы и анализ

• Используют чистые капсулы, пинцет и штатив для капсул.
• Используют капсулы для сжигания из олова.
• Капсулу подходящего размера берут пинцетом.
• С помощью специального шпателя в капсулу вводят необходимое количество образца.

Примечание.

Необходимо определить подходящее количество взвешиваемого образца, чтобы количество СО₂, получаемого из пробы и из рабочего стандартного образца (или эталонного материала), отличалось не более чем на 50 %. Чтобы не выходить за пределы этого допустимого диапазона, проводят предварительное измерение, которое позволяет определить необходимое для взвешивания количество образца (если оно неизвестно).

• Взвешивание проводят на микроаналитических весах.
• Капсулу герметично закрывают с помощью пинцета.
• Для каждого образца готовят по две капсулы.
• Капсулы помещают в штатив автосамплера элементного анализатора (при наличии). Всем капсулам должен быть присвоен порядковый номер.
• В начале и в конце серии проб всегда размещают капсулы с рабочим стандартным образцом.
• Для построения контрольной диаграммы в каждую серию проб включают контрольные образцы (например, предварительно калиброванные образцы коммерческого хитозана 4.2).

6.2.2 Контроль и регулировка оборудования для изотопного анализа

• Для обеспечения оптимального сжигания пробы температуру печи элементного анализатора, а также потоки газообразных диоксида углерода, гелия и кислорода регулируют в соответствии с инструкциями производителя оборудования.
• Проводят проверку на отсутствие утечек в системе для элементного анализа и масс-спектрометра (например, путем проверки ионного тока для отношения m/z = 40, соответствующего аргону).
• Масс-спектрометр настраивают в соответствии с инструкциями производителя оборудования.
• Перед началом измерений проб систему проверяют с помощью рабочих стандартных образцов.

6.2.3 Выполнение измерений

• Пробы последовательно помещают в автоматический пробоотборник элементного анализатора.  Газы, образующиеся при сжигании каждой пробы, последовательно подаются в масс-спектрометр, измеряющий ионные токи. Компьютер, подключенный к приборам, регистрирует интенсивность ионных токов и вычисляет значения δ для каждой пробы.

7.      ВЫЧИСЛЕНИЕ

7.1.      Коррекция и выражение данных об изотопных отношениях

По протоколу ИЮПАК значения ¹³C/¹²C и ¹⁵N/¹⁴N вычисляют по шкале дельта (δ‰) по отношению к международным эталонным образцам V-PDB (Венский стандарт изотопного состава углерода) и AIR (Атмосферный воздух) согласно уравнению 1:

где ref – международный эталонный образец; sample – анализируемая проба; ⁱE/^jE — изотопное отношение между более тяжелыми и более легкими изотопами. Затем значения дельты умножают на 1000 и выражают в промилле (‰).

Эти данные обычно рассчитывает прибор, который соотносит их со стандартными газами, используемыми для анализа (CO₂ и N₂). Полученные данные необходимо откорректировать и нормализовать. В начале и в конце серии анализируемых проб требуется поместить не менее двух международных эталонных материалов (см. таблицу 4.3) или рабочих стандартных образцов (предварительно откалиброванных) с сертифицированными значениями, которые находятся по краям диапазона измерений как для анализа углерода, так и для анализа азота. По двум точкам, полученным при измерении эталонных материалов (или рабочих стандартных образцов), строят линию интерполяции и рассчитывают соответствующее уравнение, которое затем используют для корректировки всех полученных данных.

7.2.      Контроль качества анализов

• Среднее значение, полученное для рабочих или международных стандартных образцов, используемых лабораторией, должно находиться в пределах диапазона достоверности, установленного лабораторией во время калибровки или указанного в сертификате.
• Разница между двумя повторными измерениями одного и того же образца должна составлять менее 0,3 ‰ для анализа углерода и азота.

7.3.      Оценка повторяемости и воспроизводимости метода

Межлабораторное исследование, проведенное в период с июня по сентябрь 2024 года с участием девяти различных международных лабораторий, позволило оценить повторяемость и воспроизводимость метода. Исследования повторяемости и воспроизводимости проводили с использованием шести двойных слепых образцов хитозана (всего 12 образцов), в том числе четырех из грибов и двух из внешних покровов ракообразных, имевших различные значения δ¹³C и δ¹⁵N. Кроме того, для коррекции данных с помощью двухточечной линии каждой лаборатории были предоставлены два международных стандарта с сертифицированными значениями (USGS40 L-глутаминовой кислоты с сертифицированными значениями δ¹³C = −26,39 ‰ и δ¹⁵N = −4,52 ‰ и USGS 89 свиного коллагена с сертифицированными значениями δ¹³C = −18,13 ‰ и δ¹⁵N = +6,25 ‰).

Полученные результаты (см. табл. 1 и 2 Приложения 1) позволили провести оценку приведенных ниже параметров валидации.

d13C/ ‰ отн. V-PDB
Образец	хитозан 1	хитозан 2	хитозан 3	хитозан 4	хитозан 5	хитозан 6
Кол-во достоверных результатов	9	9	9	9	9	9
Кол-во повторностей	2	2	2	2	2	2
Среднее	−20,81	−25,36	−13,03	−25,73	−21,32	−14,04
Sr	0,04	0,07	0,09	0,07	0,07	0,08
SR	0,14	0,09	0,23	0,10	0,16	0,21
d15N / ‰ отн. AIR
Образец	хитозан 1	хитозан 2	хитозан 3	хитозан 4	хитозан 5	хитозан 6
Кол-во достоверных результатов	9	9	9	9	9	9
Кол-во повторностей	2	2	2	2	2	2
Среднее	−5,39	5,05	−5,41	2,92	−4,55	−7,15
Sr	0,08	0,12	0,09	0,08	0,13	0,15
SR	0,11	0,19	0,11	0,14	0,23	0,15

7.4.      Повторяемость и воспроизводимость

Повторяемость

Абсолютная разница между двумя индивидуальными результатами, полученными с использованием идентичного образца, аналитиком, использующим одно и то же оборудование в течение наименьшего возможного временного интервала, будет превышать предел повторяемости r не более чем в 5 % случаев.

Допустимые значения относительного стандартного отклонения повторяемости (RSDr) составляют 0,09 ‰ для параметра δ¹³C и 0,15 ‰ для параметра δ¹⁵N.

Воспроизводимость

Абсолютная разница между двумя индивидуальными результатами, полученными с использованием идентичного образца в двух лабораториях, будет превышать воспроизводимость R не более чем в 5 % случаев.

Допустимые значения относительного стандартного отклонения воспроизводимости (RSDR) составляют 0,23 ‰ для параметра δ¹³C и 0,23 ‰ для параметра δ¹⁵N.

8.      РАЗЛИЧИЯ МЕЖДУ ХИТОЗАНОМ, ПОЛУЧЕННЫМ ИЗ ГРИБОВ И ВНЕШНИХ ПОКРОВОВ РАКООБРАЗНЫХ

8.1.      Граничные значения δ¹³C и δ¹⁵N при 95 % для натурального грибного хитозана

Существующие публикации (Perini et al., 2020; Claverie et al., 2023) показывают, что натуральный грибной хитозан имеет значения δ¹³C больше −14,2 ‰ или меньше −24,9 ‰ (данные взяты из приведенной публикации, имеющейся в свободном доступе). Для подтверждения грибного происхождения хитозана со значениями параметра δ¹³C в диапазоне −24,9...−25,1 ‰ требуется проведение дополнительной оценки параметра δ¹⁵N. В этом особом случае, значение параметра δ¹⁵N должно превышать +2.7 ‰.

8.2.      Рекомендации для интерпретации данных изотопного анализа

Образцы со значениями показателей изотопного состава δ¹³C и δ¹⁵N выше или ниже граничного значения 95% для хитозана грибного происхождения, как определено в п. 8.1, к которым добавляется (для верхнего предела) или вычитается (для нижнего предела) значение неопределенности, рассчитанное как 2 × S_R (см. п. 7.4), следует рассматривать как хитозан негрибного происхождения.

9.      СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Международный энологический кодекс и Международный кодекс энологических практик: Доступно по адресу: http://www.oiv.int/. OIV COEI-1-CHITOS:2009 Спецификация на хитозан.
2. Perini, M., Nardin, T., Venturelli, M., Pianezze, S., and Larcher, R., “Stable isotope ratio analysis as a fast and simple method for identifying the origin of chitosan”, Food Hydrocolloids, 2020, 101(105516), 105516.
3. Claverie, E., Perini, M., Onderwater, R. C. A., Pianezze, S., Larcher, R., Roosa, S., Yada, B., and Wattiez, R., “Multiple Technology Approach Based on Stable Isotope Ratio Analysis, Fourier Transform Infrared Spectrometry and Thermogravimetric Analysis to Ensure the Fungal Origin of the Chitosan”, Molecules, 2023, 28(11). https://doi.org/10.3390/molecules28114324

ПРИЛОЖЕНИЕ VIII.1

В табл. 1 приведены результаты определения δ¹³C, предоставленные различными лабораториями, с указанием Z-показателей.

Лаборатория	Образец 7	Образец 12	Z-показатель	Образец 6	Образец 11	Z-показатель	Образец 1	Образец 9	Z-показатель
1	−20,75	−20,69	0,63	−25,38	−25,43	−0,54	−13,04	−13,10	−0,19
2	−20,74	−20,74	0,48	−25,26	−25,30	0,86	−12,77	−12,87	0,92
3	−20,65	−20,76	0,73	−25,30	−25,32	0,52	−13,30	−13,21	−1,01
4	−20,84	−20,78	−0,02	−25,30	−25,28	0,75	−12,79	−12,92	0,76
5	−21,16	−21,05	−2,12	−25,14	−25,40	0,97	−13,12	−13,26	−0,72
6	−20,71	−20,68	0,81	−25,37	−25,50	−0,88	−13,34	−13,29	−1,27
7	−20,80	−20,82	−0,02	−25,37	−25,37	−0,15	−12,60	−12,72	1,62
8	−20,72	−20,75	0,52	−25,38	−25,40	−0,37	−13,08	−13,12	−0,32
9	−20,95	−20,95	−1,02	−25,52	−25,40	−1,16	−13,11	−12,85	0,21
Среднее		−20,81			−25,36			−13,03
Лаборатория	Образец 5	Образец 8	Z-показатель	Образец 3	Образец 4	Z-показатель	Образец 2	Образец 10	Z-показатель
1	−25,77	−25,69	−0,02	−21,10	−21,19	1,07	−14,12	−14,13	−0,41
2	−25,61	−25,60	1,27	−21,49	−21,39	−0,72	−13,73	−13,86	1,17
3	−25,68	−25,68	0,49	−21,24	−21,30	0,31	−14,26	−14,30	−1,16
4	−25,65	−25,61	1,01	−21,33	−21,24	0,22	−13,89	−13,83	0,86
5	−25,81	−25,77	−0,64	−21,51	−21,72	−1,78	−14,19	−14,11	−0,53
6	−25,79	−25,88	−1,11	−21,17	−21,03	1,34	−14,20	−14,25	−0,89
7	−25,69	−25,67	0,49	−21,29	−21,25	0,31	−13,68	−13,75	1,55
8	−25,77	−25,81	−0,64	−21,39	−21,42	−0,51	−14,11	−14,19	−0,53
9	−25,68	−25,94	−0,85	−21,38	−21,35	−0,26	−13,91	−14,19	−0,05
Среднее		−25,73			−21,32			−14,04

В табл. 2 приведены результаты определения δ¹⁵N, предоставленные различными лабораториями, с указанием Z-показателей.

Лаборатория	Образец 7	Образец 12	Z-показатель	Образец 6	Образец 11	Z-показатель	Образец 1	Образец 9	Z-показатель
1	−5,52	−5,49	−1,08	4,94	4,94	−0,59	−5,56	−5,50	−1,15
2	−5,30	−5,25	1,06	5,07	5,09	0,16	−5,36	−5,20	1,23
3	−5,40	−5,38	−0,01	5,01	5,01	−0,22	−5,41	−5,46	−0,24
4	−5,23	−5,41	0,64	5,11	4,79	−0,54	−5,29	−5,34	0,90
5	−5,43	−5,28	0,32	5,05	5,41	0,97	−5,33	−5,53	−0,20
6	−5,32	−5,19	1,24	4,73	4,79	−1,57	−5,39	−5,38	0,23
7	−5,55	−5,44	−0,99	5,12	5,01	0,08	−5,30	−5,57	−0,24
8	−5,50	−5,48	−0,94	5,08	5,10	0,22	−5,52	−5,50	−0,96
9	−5,39	−5,44	−0,24	5,30	5,35	1,49	−5,33	−5,40	0,42
Среднее		−5,39			5,05			−5,41
Лаборатория	Образец 5	Образец 8	Z-показатель	Образец 3	Образец 4	Z-показатель	Образец 2	Образец 10	Z-показатель
1	2,77	2,85	−0,73	−4,70	−4,49	−0,21	−7,23	−7,21	−0,47
2	3,02	2,92	0,37	−4,46	−4,63	0,01	−7,04	−6,87	1,25
3	2,95	2,93	0,17	−4,50	−4,46	0,29	−7,13	−7,11	0,18
4	2,76	2,64	−1,49	−5,07	−4,68	−1,41	−6,91	−7,39	−0,02
5	3,15	3,15	1,62	−4,46	−4,32	0,68	−7,19	−7,42	−1,03
6	2,73	2,92	−0,63	−4,85	−4,66	−0,90	−6,99	−6,98	1,06
7	2,85	2,88	−0,35	−4,65	−4,81	−0,79	−7,04	−7,28	−0,08
8	2,94	2,96	0,23	−4,31	−4,28	1,09	−7,22	−7,21	−0,44
9	3,14	2,93	0,82	−4,28	−4,24	1,24	−7,16	−7,27	−0,44
Среднее		2,92			−4,55			−7,15