RÉSOLUTION OENO 2/90

RECUEIL DES MÉTHODES INTERNATIONALES D’ANALYSE DES VINS

L’ASSEMBLÉE GÉNÉRALE,

VU l’Article 5, alinéa 4 de la Convention internationale d’unification des méthodes d’analyse et d’appréciation des vins du 13 octobre 1954.

SUR PROPOSITION de la Sous-Commission des méthodes d’analyse et d’appréciation des vins,

DÉCIDE d ’introduire dans Recueil des m éthodes internationales d ’analyse des vins, la méthode suivante :

Acide D-Malique

(méthode enzymatique)

1.      Principe

En présence de D-malade-deshydrogénase (D-MDH), l’acide D-malique (D-malate) est oxydé en oxalo-acétate par le nicotinamide-adénine-dinucleotide (NAD). L’oxaloacétate formé est transformé en pyruvate et acide carbonique.

(1)

La formation de NADH, mesurée par l’augmentation de l’absorbance à la longueur d’onde de 340 nm, est proportionnelle à la quantité de D-malate présente.

2.      Réactifs

Les réactifs permettant environ 30 déterminations sont présentés dans le commerce en un coffret comprenant :

1. Flacon 1 contenant environ 30 ml de solution de tampon Hepes [4-(2-hydroxyéthyl)- 1-pipérazine-éthane-acide sulfonique], pH = 9,0 et stabilisateurs.
2. Flacon 2 contenant environ 210 mg de lyophilisât de NAD.
3. Flacons 3 (au nombre de trois) contenant le lyophilisât de D-MDH, titrant environ 8 unités.

Préparation des solutions

1. Utiliser le contenu du flacon 1 sans dilution. Amener la solution à 20-25 °C avant l’emploi.
2. Dissoudre le contenu du flacon 2 dans 4 ml d’eau bidistillée.
3. Dissoudre le contenu d’un des flacons 3 dans 0,6 ml d’eau bidistilée. Amener la solution à 20-25 °C avant l’emploi.

Stabilité des solutions

Le contenu du flacon 1 se conserve au moins un an à + 4 °C ; la solution 2 se conserve environ 3 semaines à + 4 °C et 2 mois à —20 °C ; la solution 3 se conserve 5 jours à + 4°C.

3.      Appareillage

3.1. Spectrophotomètre permettant d’effectuer les mesures à 340 nm, maximum d’absorption du NADH.

A défaut, photomètre à spectre discontinu permettant d’effectuer les mesures à 334 nm et 365 nm.

S’agissant de mesures absolues d’absorbance (pas de gamme d’étalonnage, mais référence au coefficient d’extinction du NADH), les échelles des longueurs d’onde et des absorbances de l’appareil doivent être contrôlées.

3.2. Cuves de verre de 1 cm de trajet optique ou cuves à usage unique.

3.3. Micropipettes permettant de prélever des volumes compris entre 0,01 et 2 ml.

4.      Préparation de l’échantillon

Le dosage du D-malate s’effectue généralement directement sur le vin sans décolo­ ration préalable.

La quantité de D-malate dans la cuve devant être comprise entre 2 pg et 50 pg, il convient de diluer le vin de telle manière que la concentration en malate soit comprise entre 0,02 et 0,5 g/l ou 0,02 et 0,3 g/l.

Tableau de dilution

Quantité estimée de D-malate par litre		Dilution avec de l’eau	Facteur de dilution F
Mesure à
340 ou 334 mm <0,3g 0,3- 3,0 g 3,0 – 30 g >30 g	365 mm <0,5g 0,5-5,0 g 5,0 – 50 g >50 g	- 1 + 9 1 + 99 1+ 999	1 10 100 1000

Si la différence d’absorption A est inférieure à 0,100, le volume d’essai (échantillon) peut être augmenté jusqu’à 1,80 ml en réduisant le volume de l’eau à ajouter, afin que les volumes totaux soient les mêmes dans les deux cuves (essai et témoin). Tenir compte du nouveau volume de l’essai (v) pour le calcul.

5.      Mode opératoire

Le spectrophotomètre étant réglé sur la longueur d’onde 340 nm, les mesures d’absor­ bance se font dans les cuves de 1 cm de trajet optique, l’absorbance zéro étant réglée par rapport à l’air (pas de cuve sur le trajet optique) ou par rapport à l’eau.

Dans les cuves de 1 cm de trajet optique, introduire :

	Témoin	Dosage
Solution 1	1,00 ml	1,00 ml
Solution 2	0,10 ml	0,10 ml
Eau bidistillée	1,80 ml	1,70 ml
Echantillon	-	0,10 ml

Mélanger ; après environ 6 min., mesurer les absorbances des solutions témoin et

dosage (.

Ajouter :

Solution 3

0,05 ml

0,05 ml

Mélanger ; attendre la fin de la réaction (environ 20 mn) et mesurer les absorbances des solutions témoin et dosage ().

Déterminer les différences d’absorbances () du témoin ( et du dosage ( () .

Déduire la différence d’absorbances du témoin de la différence d’absorbances du dosage

Remarque : Le temps nécessaire à l’action des enzymes peut varier d’un lot à l’autre. Il n’est donné ci-dessus qu’à titre indicatif. Il est recommandé de le déterminer pour chaque lot.

6.      Expression des résultats

La concentration en acide D-malique est donnée en grammes par litre (g/l) avec 1 décimale.

6.1.      Mode de calcul

La concentration en grammes par litre est calculée par la formule générale :

V = volume du test en ml (ici 2,95ml)

v = volume de l’échantillon en ml (ici 0,1 ml)

PM = masse moléculaire de la substance à doser (ici acide D-malique = 134,09)

d = trajet optique de la cuve en cm (ici 1 cm)

= coefficient d’absorption du NADH, à 340 nm = 6,3 .1

On obtient pour le D-malate : C = 0,628 . AA

Si une dilution a été effectuée lors de la préparation de l’échantillon, multiplier le résultat par le facteur de dilution.

Remarque :

• mesure à 334 nm C = 0,640 .

= 6,2 ( .1 )

• mesure à 365 nm C = 1,163 .

= 3,4 ( .1 )

6.2.      Répétabilité (r) et reproductibilité

(R) r ~ 5%, soit r = 0,05.x.

R ~ 10%, soit R = 0,10.x.

= concentration en acide D. malique g/l.